寡核苷酸的色谱分析

随着治疗性寡核苷酸的药物应用越来越多，以及目前临床试验中的几个候选药物，需要对这些药物进行分析表征，这可能是一个挑战。用于此分析的两种高分辨率色谱选择是使用无孔阴离子交换（AEX）或多孔离子对反相（IPRP）UHPLC。这两种方法都有各自的优势，而且在选择性方面也存在差异。这里我们介绍了分离；

•单链DNA，

•故障顺序，

•荧光染料标记DNA，

•大的双链DNA片段。

介绍

合成寡核苷酸疗法广泛应用于各种应用，包括DNA扩增和测序、原位杂交、基因沉默和分子诊断。这些药物跨越了一系列寡核苷酸类别、适应症和给药途径。合成寡核苷酸以其合理的药物设计、更低的药物开发成本以及达到常规小分子药物无法达到的目标的能力，激励了药物开发人员。它们现在也成为癌症、病毒感染、阿尔茨海默病和心血管疾病等疾病的潜在治疗药物。许多治疗性寡核苷酸，包括反义、适配体和小干扰RNA（siRNAs）正在开发中。这使得对这些合成核苷酸产品的分析需求增加，超出了以前的要求。

随着第三阶段临床试验中大量治疗药物的出现，寡核苷酸领域正在接近一个关键的转折点。在未来几年内，监管机构可能会批准多种寡核苷酸疗法[1]。拥有新技术的新创业公司可能会继续推动该领域的发展，并为开发管道提供新的治疗方案。

用于分子和治疗应用的寡核苷酸需要高分辨率纯度分析，以及任何结构杂质的识别和量化。因此，这些合成寡核苷酸的质量控制至关重要，需要稳定、高分辨率的工具来提供所需的分析评估。

siRNA可用于控制翻译，从而控制导致疾病状态的特定靶蛋白的数量。RNA适配体与特定靶点具有很高的结合亲和力，本质上使其成为单克隆抗体的寡核苷酸类似物。为了在体内有效，这些寡核苷酸必须能够抵抗内源性核酸酶的攻击，这种攻击会迅速降解它们。为了实现这一点，可以通过主干的硫代化对其进行化学修饰，以抵抗酶分解，并产生治疗上可行的生物半衰期，这就对这些分子的分析特性提出了进一步的要求。

特征描述选项

随着药物应用的增加，监管机构要求的分析特征变得更加严格。此分析的高分辨率选项已被证明是无孔阴离子交换（AEX）或离子对反相（IPRP）UHPLC。两者在选择性方面都有各自的优势和差异。因此，许多实验室使用这两种技术来确保完整的特征描述。IPRP具有与质谱（MS）直接耦合的优点[1]。在本方法概述中，我们提出：

•快速、高分辨率分离单链DNA

•故障序列的分离

•荧光染料标记DNA的分离

•分离大的双链DNA片段

反相超高效液相色谱法快速、高分辨率分析ss和ds-N核酸

合成寡核苷酸在实验室中被广泛用作聚合酶链反应（PCR）和DNA测序的引物、可视化特定DNA或RNA的探针、研究基因功能的工具以及治疗各种疾病的生物制药[1,2]。合成寡核苷酸的分析通常使用离子对反相色谱法（IP-RP）[4,5]IP-RP利用分析物和离子对试剂之间的离子相互作用以及固定相和离子对药剂之间的疏水相互作用。IP-RP可提供故障序列的高分辨率分离，并可直接与质谱联用，以识别目标寡核苷酸和任何相关杂质。这里，我们使用Thermo Scientific对寡核苷酸进行HPLC-UV[6]分析™ DNAPac公司™ RP柱。

DNAPac RP柱[6]是一种反相柱，用于高分辨率分离寡核苷酸及其失效序列。其中包括经过修饰以提高生物流体稳定性的寡核苷酸，如核糖修饰、硫代磷酸（PS）取代和连锁异构体。该柱还支持限制性内切酶产生的dsDNA片段的凝胶状分离，用于克隆和下一代或高通量测序（NGS，HTS）。该色谱柱基于疏水性聚合物树脂，因此在高pH值和/或高温条件下是稳定的，这通常为具有挑战性的寡核苷酸样品提供更高的分辨率。此外，颗粒具有较大的孔径（1000~2000 Au）。

DNAPac RP柱上的宽孔可以很好地分离大的双链核酸，最多10k个碱基对，且携带量低。

树脂的疏水性来自聚（苯乙烯-二乙烯基苯）颗粒中的苯基。因此，该色谱柱可替代传统的硅胶基C18色谱柱。

单链DNA的快速、高分辨率分离

人们普遍认为，离子对试剂（如三甲胺）通过疏水相互作用与非极性固定相相互作用，而疏水相互作用又充当带负电荷的寡核苷酸的离子交换位点[1]。当pH值在6到8之间时，标准寡核苷酸对每个磷酸二酯键都有一个负电荷。因此，末端非磷酸化寡核苷酸的电荷比碱基数少1。由于磷酸二酯的数量以及IP试剂-分子相互作用的数量与寡核苷酸的长度成正比，较长的寡核苷酸在中性pH值下洗脱较晚。随着寡核苷酸的长度增加，寡核苷酸之间的电荷百分比差异减小，因此寡核苷酸之间分辨率随着寡核苷酸长度的增加而降低。使用IP-RP分离单链多脱氧胸苷（dT）如图1和图2所示。12-40mm脱氧胸腺嘧啶（dTs）的快速分离。

以乙酸三乙基铵（TEAA）为流动相，在高温高流速下以4分钟的梯度分离聚-dT 12-40mer。此外，使用7分钟梯度分离多达60个多聚-dT寡核苷酸。在这两种情况下，均使用凸梯度在较短时间内最大化较长寡核苷酸的分辨率。

故障序列的分离

合成寡核苷酸中最常见的杂质是失效序列。虽然每个耦合步骤都是高效的，但耦合失败的概率随着每个步骤的增加而增加。因此，在大多数合成的寡核苷酸中可以预期有一个或两个核苷酸“缺失”。图3显示了25毫米DNA与其5'缺失序列（n-1和n-2）的分离。

荧光灯的分离

染料标记DNA

荧光染料标记的寡核苷酸在许多应用中，如DNA测序、PCR、DNA微阵列和原位杂交。在大多数情况下，荧光团的附着增加了寡核苷酸样品的整体疏水性，导致反相固定相上的保留更强。图4显示了荧光素标记的寡核苷酸及其未修饰形式的分离。未修饰的寡核苷酸和其他杂质从主要的染料标记寡核苷酸峰中分离出来。

大双链DNA片段的分离

大的双链DNA片段的纯化和大小测定是DNA克隆、PCR和为HTS或NGS制备DNA文库的重要步骤。传统上，这些dsDNA片段由琼脂糖或丙烯酰胺凝胶分离，然后从凝胶中提取以供后续使用。这个过程需要从凝胶中手动切除目标DNA，并从切除的凝胶中提取DNA。这一费时费力的步骤通常产生的收益率不到50%。DNAPac RP提供可靠的分离和更高的产量，DNA片段收集易于自动化。许多宣传用于这种分离的反相柱都有小孔，这限制了dsDNA片段在600-1000个碱基对（bp）以上的分离。宽孔DNAPac RP树脂的分辨率可与许多DNA凝胶相媲美，最高可达10K bp，且在相同的时间内。图5显示了从限制性内切酶（底部面板）和DNA阶梯（顶部面板）生成的dsDNA片段的分离。DNAPac RP在15分钟内分离出72 bp至10000 bp的片段[6]。

总结

如果目前的第三阶段试验进展顺利，寡核苷酸的治疗用途很可能在未来几年内上市，为这些疗法寻求帮助的人带来希望。鉴于这些化合物所带来的复杂性和分析挑战，对于那些必须进行表征和质量监测的人来说，或许可以放心，因为有强大的色谱柱技术可用于快速和高分辨率分离各种寡核苷酸，包括单链和双链DNA，那些用荧光染料标记的，以及失效序列。

在这里，我们展示了用于分析这类化合物的现代创新色谱策略，以用于开发和质量控制目的。

工具书类

1.Offord，C.，《寡核苷酸治疗即将获得批准》，《科学家》，2016年12月http://www.the-scientist.com/？articles.view/articleNo/47499/title/Oligonucate-治疗学-近期批准/

2.Baek，J.、Thayer，J.，Wang，H.、Birznieks，I.、Liu，X.，新型多孔聚合物反相柱上治疗性寡核苷酸的高分辨率LC/MS分析，海报：https://tools.thermofisher.com/content/sfs/posters/PN-21515-LC-MS-Therapeutic-寡核苷酸-WCBP2016-PN21515-EN.pdf

3.直径，N。；Stein，C.A.反义寡核苷酸：基本概念和机制，《分子癌症治疗学》，2002年第1期，第347-355页。

4.雷斯尼尔，P。；蒙蒂尔，T。；马修，V。；Benoit，J.P。；Passrani，C.《siRNA纳米药物在癌症治疗中的现状综述》，生物材料，2013，34，6429-6443

5.Jose V.Bonilla，G.Susan Srivatsa，《寡核苷酸及相关产品分析手册》，第10页，2011年CRC出版社

6.Baek，J.、Thayer，J.，Lin，S.、Liu，X.，使用宽孔反相色谱柱分离大双链DNA（dsDNA）片段，应用说明：https://tools.thermofisher.com/content/sfs/brocutures/AN-21533-LC-dsDNA-Separation-AN21533-EN.pdf