使用Agilent 1290无限法开发解决方案优化分析塑料玩具中的邻苯二甲酸盐

自20世纪80年代末以来，邻苯二甲酸盐一直被怀疑对人类健康构成威胁。从那时起，欧洲、美国、中国和其他国家的官方机构已经通过了邻苯二甲酸盐的法规，尤其是塑料玩具中的邻苯二酸盐。

许多官方方法都是基于GC或GC/MS方法，但在过去十年中，发展了LC和LC/MS方法。本申请说明显示了使用苯基己基柱和三元梯度对九种邻苯二甲酸盐进行HPLC/UV分析的方法。方法开发使用了安捷伦1290无限方法开发解决方案和安捷伦方法搜索向导。对于保留时间和面积的最终方法精度，评估了检测限（LOD）和定量限（LOQ）以及线性。对玩具中的塑料材料进行了分析，并测定了邻苯二甲酸盐的含量。此外，还开发了一种快速UHPLC方法，并与高分辨率方法进行了比较。

介绍

塑料玩具[1]、市政和废水[2-4]、纺织品[5]和食品[6]中邻苯二甲酸盐的允许含量已在全球范围内制定了法规。2005/84/EC1指令列出了六种邻苯二甲酸盐（表1），当用作玩具和儿童保育用品中的增塑剂时，需要对其进行监测，并且必须≤产品质量的0.1%。更严格的规定正在考虑中[7]。DEHP、DBP和BBP被归类为对生殖有毒，欧盟特别禁止它们用于婴儿产品。

例如，替代品可以是DIDP和DINP，它们到目前为止还不被视为有毒，但是，婴儿产品中也禁止使用这些软化剂。DINP和DIDP似乎在环境中迅速传播，并在生物体中富集。因此，应禁止他们进入环境。德国“Umwelt Bundesamt”建议在可能的情况下，用无邻苯二甲酸盐材料（如聚乙烯和聚丙烯）逐步取代所有含邻苯二酸盐的材料，如柔性PVC[8]。

在下文中，针对九种邻苯二甲酸盐开发了HPLC/UV方法，见表1。采用苯基己基柱和C18柱进行优化分离。

此外，使用乙腈和甲醇作为有机相的二元和三元梯度。对该方法的性能进行了评估，并对实际样品进行了测量。此外，将开发的方法转换为快速UHPLC方法。

实验

仪表

安捷伦1290无限法开发解决方案

四元泵G4204A

自动取样器G4226A

ALS冷却器G1330B

柱1配有高压G1316C柱切换阀

2号塔配有低压G1316C塔切换阀

二极管阵列探测器G4212A

阀驱动G1353B

方法开发工具包G4230B

低分散毛细管试剂盒G4212A

样品制备

将0.05g压碎的聚合物样品溶解在5mL THF中。用10mL甲醇沉淀聚合物并冷却1小时。当聚合物沉淀后，通过0.45-μm安捷伦Captiva高级注射器过滤器（再生纤维素，p/n 5190-5111）过滤溶液，蒸发，然后用500μL乙腈稀释。

方法开发的色谱条件

化合物9邻苯二甲酸盐

第1列安捷伦ZORBAX Eclipse Plus Phenyl Hexyl，3°x 100mm，3.5μm，零件号959961-312

第2栏安捷伦Zorbax Eclipse Plus C-18，3°x 100mm，3.5μm，d/w 959961-302

流动相水（A）、乙腈（B）、甲醇（C）

梯度1/0分钟10%B，10分钟90%B

0分钟10%C，10分钟90%C

梯度3/0分钟5%B，5%C，10分钟&&45%B，45%C

流速1 ml/min

进样量1μL

柱温40°C

检测228/6 nm，参考380/80 nm，20 Hz，10-mm电池

高分辨率UHPLC的色谱条件

第1列安捷伦ZORBAX RRHT Eclipse Plus Phenyl Hexyl，3°x 100mm，1.8μm，p/n959964-312

流动相水（A）、乙腈（B）、甲醇（C）

0分钟5%B和5%C、10分钟45%B和45%C、12.45分钟45%B与45%C、12.5分钟90%B、14分钟5%B与5%C的梯度

流速1 mL/min

运行时间15分钟

发帖时间3分钟

进样量1μL

柱温40°C

检测228/6nm，参考380/80nm，20 Hz，10-mm电池

快速超高效液相色谱的色谱条件

第1列安捷伦ZORBAX RRHT Eclipse Plus苯基己基，2.1°x 50mm，1.8μm，零件号959757-912

流动相水（A）、乙腈（B）、甲醇（C）

0分钟5%B和5%C的梯度，2.5分钟45%B和45%C的梯度

流速2 mL/min

运行时间：3.5分钟

发帖时间：1分钟

进样量：1μL

柱温：50°C

检测：228/6nm，参考380/80nm，20 Hz，10-mm电池

分析的化合物

表1。分析样品

结构

由欧盟提供

苯甲酸苄酯BB疑似过敏原

邻苯二甲酸二甲酯DMP（EPA标准）

丁基苄基-BBP邻苯二甲酸盐再生毒性（EPA标准）

邻苯二甲酸二丁酯再生DBP（EPA标准）

邻苯二甲酸二辛酯DNOP潜在风险（EPA标准）

邻苯二甲酸二异癸酯DIDP潜在风险

邻苯二甲酸二（2-乙基己基）酯DEHP再生剂

邻苯二甲酸单甲酯MMP（尿液中的降解产物）

EPA邻苯二甲酸酯混合物（48805-U）、邻苯二酸二异辛酯（80135-10mL）和邻苯二甲酸单甲酯（36926-250 mg）以及苯甲酸苄酯（N11182-1g）购自德国Sigma-Aldrich。

被分析化合物的光谱

采办与评估软件

安捷伦OpenLAB CDS ChemStation版本C.01.05

安捷伦方法搜索向导A.02.02版

结果和讨论

使用了以下工作流：

•使用不同色谱柱和不同流动相的方法开发

•最终高分辨率UHPLC方法的方法验证

•实际生活样本分析

•快速UHPLC方法的开发

•高分辨率UHPLC与快速UHPLC的比较

方法开发

采用了两种不同选择性、三个梯度的色谱柱，以乙腈、甲醇或乙腈和甲醇的组合作为有机相。在一个小瓶中分析了含有六种化合物的EPA标准。用同样的方法测试了另外两个含有其他化合物的小瓶。

由于每次样品运行大约需要18分钟，因此在10.5小时后完成方法考察。有关1290无限方法开发解决方案的更多信息，请参阅参考文献[9,10]。使用苯基己基柱结合乙腈和甲醇作为有机相获得最佳分离（图1）。

使用相同的色谱条件，C18柱对DEHP、DNOP和DIDP的分辨率较低。为了进一步提高分辨率和信噪比，将含有3.5-μm颗粒的苯基己基柱替换为含有1.8-μm粒子的苯基己基柱（图2）。所有其他柱尺寸保持不变。

分辨率、峰宽和峰高都得到了提高。

图1。使用苯基己基柱和乙腈和甲醇组合分析邻苯二甲酸盐。

图2。不同粒径的比较。

方法性能

根据在含有1.8μm颗粒的苯基己基柱上获得的实验，评估了以下方法性能参数（表2和表3）：

•保留时间的精确度

•面积精度

•线性

•LOD和LOQ

Table 2 shows the combined precision data for retention times and areas. The precision for retention times was typically < 0.01% RSD. The precision for the areas was typically < 0.73% RSD.

通过注射低水平的邻苯二甲酸盐来测定LOD和LOQ（图3）。

表2。保留时间和面积的精确度。

复合RSD RT（%）RSD量（%）

基质金属蛋白酶（600 ng）0.099 0.594

DMP（20 ng）0.007 0.701

DEP（20 ng）0.005 0.163

BB（90克）0.007 0.717

BBP（20 ng）0.01 0.574

DBP（20 ng）0.009 0.506

DEHP（20纳克）0.007 0.521

DNOP（20 ng）0.007 0.568

DIDP（1800 ng）≤0.009≤0.728

图3。用于测定LOD和LOQ的色谱图。

表3显示了LOD、LOQ和分辨率的综合结果。

通过注入2000、500、125、31.25、7.812和1.953 ng/μL的EPA标准来评估线性。与响应因子相关的注射量在7.8到2000ng之间呈线性，见图4中的示例。对于所有标准，相关系数&#62;0.99998。

表3。LOD、LOQ和分辨率。

Amount Signal-to- LOD with LOQ with Resolution used for noise S/N=3 S/N =20 based on LOD and (S/N) ng/µL ng/µL EPA 20 ng LOQ each (ng/µL) MMP 340 ng BB 290 ng DIDP 1720 ng

MMP 34 96.6 1.1 7.3–

DMP 2 74.6 0.08 0.54 65.15

环境保护部2.6 74.08 0.54 34.86

BB 29 200.3 0.44 2.9 39.03编号

国内生产总值2 63 0.1 0.63 19.41

DBP 2 62.3 0.1 0.64 4.66

DEHP 2 68.9 0.09 0.58 57.19（DEHP 2）

DNOP 2 48.2 0.12 0.83 5.57

DIDP-172-113.6-4.5-30-4.33

真实生活样本的分析

回收率是通过在玩具的塑料材料中加入EPA标准来测量的。样品制备后，所有六种化合物的理论浓度均为100ng（图5）。回收率在66%到76%之间。

The analysis of plastic material from a baby toy showed that the phthalate concentration was far below the allowed limit of 0.1% = 100ng total, related to the extracted material of 0.05g, (Figure 6). The standard contained the six EPA phthalates and the three additional compounds MMP, BB, and DIDP.

确认存在DIDP。UV库的DIDP光谱与样品的峰值光谱不一致。

图4。以DBP的线性度为例。

图5。分析添加到塑料基质中的EPA标准。

图6。将标准色谱图与提取塑料材料的色谱图重叠。

转换为快速UHPLC方法

所开发的高分辨率UHPLC方法需要大约18分钟的循环时间，这使得样品分析具有高分辨率和高精度。在某些情况下，快速获得结果是有利的，例如，快速筛选大量样品。为了缩短循环时间，将色谱柱长度减半，流速加倍。通过使用ZORBAX RRHD苯基己基柱，内径减小至2.1mm，允许背压高达1200巴。在2 mL/min流速下，快速UHPLC分析的最大压力约为1100 bar。循环时间缩短至4.5分钟（图7）。

注入加标基质表明，也可以应用快速UHPLC条件进行识别和定量（图8）。

图7。从高分辨率和快速UHPLC运行中接收的色谱图叠加。

图8。标准和加标基质色谱图的叠加。

高分辨率UHPLC与快速UHPLC的比较

如果快速筛选是最重要的分析要求，则缩短4.5分钟的循环时间是有利的。正如预期的那样，快速UHPLC方法的性能不如高分辨率UHPLC方法（图9和图10）。

高分辨率UHPLC方法的分辨率平均比快速UHPLC方法高60%。

平均而言，对于高分辨率方法，保留时间的精确度提高了10倍，但对于快速分析，最大SD值为0.00868分钟。这意味着保留时间标准偏差小至0.52秒，例如，对于1.938分钟的峰值BB洗脱。除DEHP和DNOP外，对于分辨率良好的峰，面积精度是可比较的。

图9。分辨率比较

图10。精度比较

结论

使用UHPLC/UV方法分析了六种限制性EPA邻苯二甲酸盐、DMP、DEP、BBP、DBP、DEHP和DNOP，以及MMP、BB和DIDP，该方法可在18分钟的循环时间内进行分离。必须使用苯己基柱和三元梯度，以乙腈和甲醇为有机相，以实现最佳分离。方法开发是使用1290无限四元方法开发解决方案结合方法搜索向导完成的。对最终的18分钟高分辨率UHPLC方法的性能进行了评估，并对实际样品进行了测量。测定产品质量中0.1%的任何限制性EPA邻苯二甲酸酯是可行的，具有较高的精度。为了进行鉴定，除了保留时间外，还使用了光谱库中存储的UV光谱。此外，开发了一种快速筛选方法，周期时间低至4.5分钟。