为什么我的方法不可靠？

随着《今日色谱帮助台》的第一版，人们认为最常见的问题之一，即非稳健方法，应该得到解决。为什么化验总是失败，如何才能使其稳定，这是一个让许多科学家和实验室管理人员夜不能寐的问题。然而，用户面临的最大问题之一是，该分析已经过验证，并提交给了全球各地的各种监管机构，重新验证的成本问题变得令人望而却步。

那么，分析如何可能变得不稳定，在方法开发过程中需要发生什么才能确保分析更加稳定，要监测的关键实验参数是什么？这里可以使用不同的方法，下面的建议可以明确使用，也可以用作一般指南。

当分析开始失败时，信息是理解真正问题的关键。收集的信息应包括：；

•之前分析的样品批次数据

•验证研究数据

•方法开发研究的数据

•

正在分析的化合物（如果已知）

•了解哪些参数

已更改

就后一条评论而言，在解释这些信息时必须小心。有时，“为什么我的化验有效？”可能是一个比“为什么化验无效？”更相关的问题。有一种自然的假设，即如果化验有效一段时间后失败，那么失败的原因是由于一个正在更改的参数造成的，虽然这通常是正确的，但并不总是如此。这里的一个重要问题是，一些化验结果并不稳定，因此，分析人员或供应商可能无法控制的相对较小的变化会导致化验失败。这与Edward Lorenz[1,2]开发大气模型时面临的问题非常相似，他发现输入参数的微小变化对全球天气系统产生了重大影响，即所谓的“蝴蝶效应”，图1。在这种情况下，Lorenz观察到，输入参数在一个看似简单的全球天气数学模型中的微小变化，只涉及三个参数，可能会对最终的天气系统产生巨大影响。洛伦茨说，这就像一只蝴蝶扇动翅膀，在世界的另一个地方引发飓风。以下问题就是这种情况的示例。

图2显示了分离科学家可能遇到的实际问题。最初的分析在一个色谱柱上进行了验证，随后使用同一色谱柱运行初始样品集。该柱提供了所需的分离，并被发现具有非常稳定的保留时间。最终，该列需要更换，而这正是问题开始的地方。在收到新的色谱柱时，客户注意到新色谱柱上的一些峰的分辨率有很大损失。因此，人们认为问题出在专栏上，所以客户尝试另一个专栏，结果发现该专栏提供的解决方案与第二个专栏的质量类似。

很明显，这一定是专栏，因为这是唯一改变的参数，但随着对数据和实验参数的进一步调查，另一个故事开始浮现。需要注意的第一点是，保留时间的变化只影响两种成分，所有其他峰都有稳定的保留时间，这表明这两种成分的保留机制正在改变，但其他成分的保留机理没有改变。这在色谱法中非常罕见，尤其是在反相色谱法中，在同一色谱柱上不常见不同的主要机制。众所周知，当使用一些早期的硅胶柱时会发生这种情况，由于其金属含量高，其行为几乎类似于混合模式相[3-6]，除了疏水相互作用外，还具有离子交换能力。

这两种异常化合物表明，需要对数据进行进一步研究，以便计算所研究分子的物理化学性质[7]，图3。值得注意的是，这两种问题化合物都是碱，中性和酸性成分不受色谱柱变化的影响。图3所示的对数D图（疏水性随pH值的变化）的研究突出了分析中的一个潜在缺陷，因为两种碱的pKa与操作pH条件非常相似。在随后的CT帮助台中，将继续讨论log D和pKa在获得理想色谱中的重要性。一个好的方法开发人员会知道，分子的pKa及其周围可能存在一些保留时间不稳定性。许多现代药物都会有几个pKa，因为分子结构中存在着大量的离子化基团；事实上，有一些规则规定，一种化合物要成为一种好的药物，它必须有多个电离基团[8]。

由于这项研究，在较低pH值下开发了一种新方法，如图4所示，并在三个不同批次的三个不同柱上进行了测试。由此产生的色谱需要进一步优化，以分离所有成分，但色谱图所示仅与所用pH值的原始方法不同，确实表明色谱在各个柱之间是稳定的，尤其是导致原始方法出现问题的基本化合物。

使用预测软件[7，9-12]可以使方法优化和分析稳定性测定的任务轻松得多，实际上消除了对大量实验数据的需要，从而确保分析的稳定性。市场上有许多商业化的产品，大多数产品都是基于众所周知的理论模型，对于大多数实验安排来说，这些产品都非常有效。

结论

为避免分析不稳定，色谱分离必须稳定，以防出现分析科学家无法控制的微小变化。因此，重要的是通过改变最终分析条件的一系列参数来检查分析的稳定性。这应包括：

•温度变化±5°C

•pH值变化±2个单位

•使用至少三种不同的色谱柱介质和溶剂

•通过运行不同制造商的泵，检查停留体积对分析的影响。

使用预测软件工具可以大大减少宝贵的实验室时间；然而，沿着这条路线走下去会产生初步的成本影响。