色谱分离和串联质谱（MS/MS）鉴定是“自下而上”蛋白质组学分析的基础，由于仪器的进步，这两个关键步骤近年来性能显著提高。最新的超高效液相色谱（UHPLC）系统提供的高背压允许使用更长、更高效的毛细管柱，当与高分辨率Orbitrap质谱仪技术结合使用时，可以实现更高水平的肽鉴定，蛋白质定量和分析吞吐量。在这里，我们使用75 cm长的毛细管柱对HeLa细胞裂解液进行了增强的蛋白质组分析，并将这些结果与使用50 cm柱获得的结果进行了比较。柱长的增加导致分离和检测了更多独特的肽，提高了蛋白质定量，以及更好的再现性和吞吐量，突出了该LC-MS/MS方法对复杂裂解物定量的适用性。
介绍
蛋白质组分析的“自顶向下”方法基于串联质谱（MS/MS）对完整蛋白质的直接裂解和分析，而传统的“自下而上”蛋白质组技术则由三个主要步骤支撑：蛋白质消化、色谱分离和MS/MS鉴定。尽管在过去二十年里，技术和方法取得了重大进展，但蛋白质组分析的“自下而上”方法面临着许多关键挑战。
一个挑战与蛋白质组鉴定的深度有关，使用当前的液相色谱（LC）-MS/MS技术通常只回收了一小部分肽群[1]。第二个挑战涉及这些方法的敏感性和动态范围，因为临床活检等样本的大小有限[2]，并且需要对跨越几个数量级的浓度进行准确的肽定量[3]。最后，由于许多研究涉及跨多种条件对大量样品进行蛋白质组学分析以得出有意义的结论，因此实现高水平的分析吞吐量至关重要[4]。
仪器仪表的最新进展正在应对这些挑战方面取得重大进展。Orbitrap质谱仪被广泛认为是基于质谱的蛋白质组学的金标准，具有一流的灵敏度、质量分辨率和扫描速度[5]。然而，为了实现蛋白质识别和定量的最佳效率，这种强大的检测技术必须与同样有效的分离方法相结合。纳米色谱法使用50至75µm内径的熔融石英毛细管，基于由2至3µm大小的二氧化硅颗粒支撑的反相固定相，已被证明对此特别有效。通常，75µm i.d.毛细管柱以高达400 nL/min的流速运行，早期自下而上的蛋白质组学实验通常使用15至25 cm长的毛细血管，梯度在15至60分钟之间[6]。
近年来，在限制肽分离效率方面取得了很大进展。分离性能可以根据峰值容量（Cp）进行量化，峰值容量定义为在给定时间内可以分离的最大组分数量。Mechtler及其同事已经证明，对于填充反相液相色谱柱，在给定梯度下可以获得的最大色谱柱峰容量与长度的平方根成正比，或者，如果色谱柱长度保持不变，则与粒径成正比[7]。换句话说，在给定的分离时间内，使用较长的毛细管或较小的颗粒可以实现更好的肽分离。
最新的超高效液相色谱（UHPLC）系统现在允许高达1200巴的背压，从而可以常规使用更长、更高效的色谱柱。在这里，我们使用75 cm长的毛细管柱和2小时和4小时的色谱梯度，对HeLa细胞裂解液进行了改进的蛋白质组分析，并将这些结果与使用50 cm柱获得的结果进行了比较，50 cm柱是目前市场上最长的高性能纳米LC柱。
实验
材料：所有溶剂均为LC-MS级，购自Fisher Chemical。蛋白质消化液和校准标准从赛默飞世尔公司购买。在含有0.1%甲酸的水中制备含有500 ng/µL Pierce HeLa蛋白消化物（Thermo Fisher）（产品目录号：88328）和50 fmol/µL皮尔斯肽保留时间校准标准物（产品目录编号：88321）的等分样品用于研究。将2或4µL（相当于1或2µg）的HeLa细胞消化液直接注射到柱上。
色谱法：使用EASY-nLC 1200 UHPLC系统（Thermo Fisher）进行分析。本对比研究中使用了两个Acclaim PepMap C18 EASY-Sraph色谱柱（2µm粒径，75µm i.d.），（Thermo Fisher）长度分别为50 cm和75 cm。使用Dionex nanoViper指套（Thermo Fisher）将色谱柱连接至LC系统。溶剂A是含有0.1%甲酸的水，溶剂B是乙腈-水的80:20混合物，也含有0.1%的甲酸。表1总结了使用的梯度法。在所有实验期间，保持55˚C的恒定柱温。梯度持续时间和柱长之间的进样、样品加载、柱平衡和自动进样器清洗条件是一致的。两个色谱柱的流速均为300 nL/min，导致75 cm色谱柱的背压约为900 bar，50 cm色谱柱约为600 bar。
质谱分析：使用Orbitrap Fusion Lumos MS（Thermo Fisher）进行肽MS/MS分析。在120K全宽半最大（FWHM）分辨率（200 m/z）下，以375至1575 m/z的速度对肽前体进行检测扫描，目标离子数为4 x 105，最大注射时间为50 ms。仪器以最高速度模式运行，检测和ms/ms扫描周期为3 s。在调查扫描后，对最丰富的前体进行串联质谱，其电荷状态为2至7，强度大于5 x 103。在1.2 Th时，在四极中分离出前驱体。以35%的碰撞能量进行CID裂解，并使用离子阱中的快速扫描速率检测得到碎片。MS/MS的自动增益控制目标设置为104，最大注射时间限制为35 MS。使用12 s的动态排除时间，前体及其同位素周围的质量容差为10 ppm，并启用单同位素前体选择。
数据分析：使用Proteome Discoverer软件（Thermo Fisher）处理原始数据。利用SEQUEST HT引擎对42085个人类蛋白质（包括蛋白质组（Uniprot））的数据库搜索MS2光谱。使用胰蛋白酶裂解生成硅内肽序列，允许最多两个缺失裂解；半胱氨酸残基的氨基甲酰化（57.021Da）被设定为固定修饰。蛋氨酸残基的氧化（15.9949 Da）、蛋白质N末端的乙酰化（42.0106 Da）以及天冬酰胺和谷氨酰胺的脱酰胺（0.984 Da）被视为可变修饰。前体质量容差为10 ppm，产品离子的容差为0.8 Da。基于1%错误发现率（FDR）下的q值，使用Percolator算法[8]验证肽谱匹配。利用蛋白质组发现器，根据简约定律将肽鉴定分为蛋白质，并过滤至1%FDR。使用前体离子面积检测器插件从识别的肽中提取前体离子区域。为了进一步分析，导出光谱匹配和通过FDR的肽组，并使用DAnTE RDN进行处理[9]。使用Skyline软件提取Pierce保留时间校准标准的离子色谱图，以计算FWHM值、变异系数、保留时间变异和肽峰容量。
结果和讨论
使用EASY-nLC 1200 UHPLC系统和Orbitrap Fusion Lumos质谱仪，在2小时和4小时梯度下，使用50cm和75cm长、内径75µm的毛细管柱分离HeLa细胞裂解液。图1显示了每个研究柱和梯度的代表性色谱图。
高分析再现性和吞吐量
为了在不同时间和不同条件下测量的样品之间进行可靠的比较，并最终获得有关蛋白质组的定量信息，色谱分离的重现性至关重要。对于每个实验装置，发现重复之间的峰值曲线几乎相同，即使采用240分钟的梯度，也观察到肽保留时间偏移小于1分钟。
四种实验条件下的基峰色谱图也一致。两个色谱柱之间几乎没有观察到差异，这是可以预料的，因为色谱柱包含相同的填料。然而，由于柱长度增加和柱移动时间延长，观察到使用更长的柱获得的保留时间发生了小幅度的变化。
添加到样品中作为质量控制的15种PRTC标准的色谱性能参数如图2A所示。75 cm色谱柱的性能优于50 cm色谱柱，其中肽峰面积中值、半高宽值和保留时间的变异系数等于或低于使用两种梯度长度获得的较长色谱柱的变异系数。
方程1中定义的峰值容量（Cp）[10]（其中n是用于计算的峰值数量，TG是梯度长度，Wp是峰值高度一半最大值的宽度）也用于评估每个实验装置的分析能力。使用此分析，更长的梯度方法和更长的列长度提高了性能，如图2B所示。使用240分钟的梯度，75厘米柱的Cp为827，几乎是谢长廷等人[11]所得Cp的两倍。
方程式1
对于许多涉及大样本量采样的蛋白质组学应用，高分析吞吐量至关重要。事实上，使用较短梯度时间的75 cm色谱柱获得的Cp超过了使用较长梯度时间的50 cm色谱柱的Cp，这突出了使用较长色谱柱的效率提高。此外，由于使用75 cm色谱柱的背压未达到EASY-nLC 1200系统的最大额定值，通过进一步优化LC-MS/MS参数，使用该色谱柱实现的分离可能会得到进一步改进。
深入研究蛋白质组
在给定分析中确定的肽数量是蛋白质组研究中的一个重要参数，可以直接影响结果的可信度和结论的影响。如图3所示，75厘米的色谱柱始终以至少7%的余量获得了最多的肽和蛋白质鉴定。虽然使用较小的色谱柱通常会导致约80%的重复性，但在本研究中，在三次重复分析中，给定数据集的95%以上的肽和蛋白质鉴定是与另一个复制品共享的。
Orbitrap Fusion Lumos仪器具有更明亮的光源和更高的传输四极，其超快扫描速度高达20 Hz，能够在双线性离子阱中执行并行前体离子隔离、碎片化和扫描，确保在调查扫描中检测到的大多数离子被有效地分割，从而获得更好的肽和蛋白质鉴定。
如图4A所示，75 cm色谱柱在整个LC-MS/MS梯度中始终产生更好的肽识别。这种增强的性能可以通过75 cm色谱柱实现的改进分离来解释，该色谱柱允许给定肽以更高的浓度洗脱，产生更高质量的MS/MS光谱，进而产生更积极的鉴定结果。图4B显示了4小时梯度中已识别和可量化的蛋白质的等级，正如预期的那样，较长的列深入到蛋白质组覆盖范围。
路径分析的结果显示，这两个列的过度表达路径具有相同的轮廓，但覆盖程度不同，表明整个研究没有偏见。图4C显示，采用4小时梯度获得的75 cm色谱柱数据可直接定量23条过度表达途径中每一条中约一半的蛋白质。
改进的定量
定量方面也取得了实质性改进。使用75 cm的色谱柱，可量化肽的数量增加了20%，这不仅增加了量化肽的数目，而且重复之间的相关性也更高（>85%）。这些肽和蛋白质的变异系数越低，定量也越准确。
将加载到色谱柱上的肽消化物数量加倍，从1µg增加到2µg，对可量化肽或蛋白质鉴定的数量没有显著影响。然而，增加装载量确实将运行之间的相关性提高到89%，并且导致变异系数低于5%的蛋白质数量增加一倍，。这种性能上的改进突出了使用更大负载量进行更准确蛋白质组定量的潜力。
结论
最新UHPLC系统提供的高背压允许使用更长的色谱柱，当与最先进的Orbitrap质谱仪结合使用时，可以在最大限度提高产量的同时实现更高水平的肽和蛋白质鉴定。这些技术为进行高性能蛋白质组学研究提供了一个非常强大的平台，因为它们提供了卓越的运行到运行的再现性和分析深度，并允许高样本装载能力。
将柱长从50厘米增加到75厘米，可以分离和检测10%以上的独特肽，并鉴定7%以上的蛋白质。使用该装置，我们在不需要分馏的情况下鉴定了约6500个蛋白质，并仅通过三次技术重复注射，对5000多个蛋白质进行了可重复的定量，突显了该方法作为定量蛋白质组学的高效可靠替代方法的潜力。
暂无评论
发表评论